胰腺炎的饮食

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8中性粒细胞分型单细胞富 [复制链接]

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今天给同学们分享一篇中性粒细胞+分型+单细胞的生信文章“Novelinsightonmarkergenesandpathogenicperipheralneutrophilsubtypesinacutepancreatitis”,这篇文章于年5月16日发表在Frontlmmunol期刊上,影响因子为8.。

急性胰腺炎是一种全球常见的危重急性胃肠疾病,患病率逐渐增加。然而,外周血基因表达模式尚未完全分析。此外,尚未研究冠状病毒病(COVID-19)引起的急性胰腺炎的机制。

1.鉴定具有显著通路和中心基因的差异表达基因

GSE数据集包括了来自AP患者外周血的mRNA表达数据,其中疾病组包括57个轻度胰腺炎样本、20个中度重症胰腺炎样本和10个重度胰腺炎样本,健康对照组包括32个样本。通过DEseq2软件包进行差异表达分析(logFC1,p0.05)(图1A),共鉴定出1,个差异表达基因(DEGs)。如图1B所示,前50个上调和下调基因的转录表达能够区分大部分疾病样本,尤其是重度样本,与健康样本有所区别(图1B)。“中性粒细胞颗粒溶解”是富集术语条形图中的一个显著通路(图1C)。“应激反应”是基因本体分析中最显著的术语(图1D)。这些术语强调了中性粒细胞在AP发生中的关键价值。PPI分析表明存在一些具有显著密度的模块,包括一个包含IL-1R1、IL-1RN、IL-1R2、IL-10和MMP1的模块,一个包含HIST家族基因的模块,以及另一个包含MAPK相关基因的模块(图1E)。IL-10、IL-6、OSM、MMP9、MMP1、LCN2、HGF、TIMP1、IL1B和HIST1H4F被确定为前10个富集基因(图1F、G)。

图1

2.通过WGCNA鉴定急性胰腺炎中的关键基因模块

为了进一步阐明正常外周血和AP的不同亚型(MAP、MSAP和SAP)之间的潜在机制和基因模块,作者在批次归一化后对两个数据集的疾病样本进行了WGCNA分析(图2A)。如图2B、C所示,所有样本都被纳入分析,最佳向量幂设置为11。棕色模块和青色模块是与AP严重程度呈负相关和正相关的两个显著基因模块(图2D)。其他基因模块具有紧密的基因调控网络(图5C)。WGCNA的结果表明,棕色模块和青色模块中的基因共同调控AP的生物过程。

图2WGCNA结果显示急性胰腺炎的不同亚型

3.WGCNA结果显示急性胰腺炎的不同亚型

为了进一步研究已确定模块中的基因功能和重要的KEGG通路,作者使用了Metascape数据库。与T细胞激活和病毒感染相关的“RNA代谢”通路在蓝绿色模块中显著富集。蓝绿色模块的通路网络显示这三个相关通路是独立作用的(图3A)。此外,“中性粒细胞颗粒溶解”,“炎症反应”和“对细菌的反应”在棕色模块中显著富集。蓝绿色模块的通路网络显示这些相关通路是协同作用的(图3B)。

图3

4.急性胰腺炎中免疫细胞亚型和可靠生物标志物的鉴定

在免疫细胞类型浸润分析中,结果显示随着AP的进展,外周血DCs、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞呈逐渐增加的趋势,而B细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、Treg细胞、辅助T细胞(Th细胞)、Th1细胞、Th2细胞和Tfh细胞呈逐渐减少的趋势(图4A)。然后,在重症AP组(MSAPSAP)和对照组(健康对照组和MAP)之间进行了随机森林分析(图4B)。列出了前30个基因(图4C)。在这些基因中,有10个基因具有显著的诊断价值(AUC0.8),包括SA6、SA9、SA12、CD63、ITK、CD5、ANXA3、KLF12、TRABD2A和CCR7(图4D)。

图4

5.验证可靠的生物标志物以监测急性胰腺炎的严重程度

如图5A所示,所有八个基因在健康对照组、MAP组和MSAPSAP组之间均显示出显著差异。由于检测误差率较低,表达较高的基因更适合作为诊断因子。根据这一标准,筛选出三个具有显著诊断价值的基因(最小相对表达量),包括SA6、SA9和SA12。为了测试这些基因在AP严重程度鉴定中的稳定性,收集了28个外周血样本,并检测了这些基因的相对表达量。根据AP的严重程度(MSAPSAP组和MAP组),在所有基因的表达值中发现了显著差异(图5B)。ROC分析也验证了这些基因在SAP和MAP之间具有显著的诊断价值(图5C)。

图5

6.急性胰腺炎和COVID-19之间常见生物过程和关键外周血细胞类型的鉴定

为了进一步探索COVID-19引起的胰腺炎中的常见生物过程和关键细胞类型,本研究使用了GSE数据集。通过DEseq2软件包鉴定出了个差异表达基因。在AP和COVID-19患者的外周血中,共鉴定出个上调基因和12个下调基因(图6A)。在这些共同基因的KEGG通路分析中,“中性粒细胞去颗粒化”显著富集(图6B)。在网络的中心角色中,发现了“中性粒细胞去颗粒化”通路具有最显著的价值(图6C、D)。

图6

7.单细胞数据集中中性粒细胞类型的鉴定

正如介绍中所提到的,一项先前的研究表明,COVID-19引起的败血症有可能诱发和加速AP(5-8)。然而,关于细菌引起的败血症,另一种常见的败血症原因,目前没有相关报告。根据作者上面的分析,中性粒细胞可能是COVID-19感染和外周血中AP之间的一个重要亚型共同致病因子。因此,作者接下来通过分析单细胞测序数据来研究细菌引起的败血症和COVID引起的败血症之间中性粒细胞的变化,以确定COVID-19引起的AP的外周血致病因子。如图7A所示,在接下来的步骤中选择0.05作为分辨率。1、6和9组被确定为中性粒细胞(图7B-D)。

图7

8.不同中性粒细胞类型的鉴定

然后,被鉴定出来的中性粒细胞被筛选并提取进行以下分析。鉴定出了五个中性粒细胞亚群(图8A-C)。如图8D所示,0组在COVID-19组中显著上调,3组在细菌引起的败血症中显著增加。每组筛选出了前10个基因(图8E)。重要的是,0组中的前列基因与IFN反应性表型和炎症有关。3组和4组更有可能表现出增殖表型。中性粒细胞脱颗粒与中性粒细胞的激活密切相关。中性粒细胞脱颗粒的标记基因包括MPO、ELANE、CAMP、CYBA、MMP8和MMP25。如图8F所示,中性粒细胞脱颗粒的标记基因在0组中显著上调。总之,0组代表一种成熟激活的中性粒细胞亚型,主要富集在COVID-19引起的败血症中,具有高表达的IFN相关基因。

图8

9.零型中性粒细胞是急性胰腺炎相关的潜在致病亚型,与干扰素分泌有关,并在急性胰腺炎患者的外周血中上调

最后,在单细胞通路分析的验证后,将0组确定为与干扰素相关的组(图9A、B)。伪时序位点分析显示,5组代表败血症中中性粒细胞的原始和非活化表型,而0组的进化轨迹与其他成熟中性粒细胞不同(图9C、D)。然后,在0组中发现了一些常见的与代谢相关的通路,包括“脂肪酸降解”、“α-亚麻酸代谢”、“硫代谢”和“脂肪酸生物合成”(图9E、F)。最后,为了进一步验证已确定的与干扰素相关的中性粒细胞致病亚型,使用cibersoftx软件估计了单细胞测序数据中所有中性粒细胞中已确定亚型的比例,包括AP患者和健康对照组(基于前一个GEO批量测序数据集:GSE)。该亚型在健康对照组的外周血中几乎为0,在AP患者的外周血中显著上调,并随着疾病严重程度的增加而增加(图9G)。

图9

总结

总之,作者首次对来自超过87个人类血液样本的测序数据进行了WGCNA分析,将其分为健康组、MAP组、MSAP组和SAP组,并确定了与AP严重程度相关的两个功能基因模块。这是首个使用WGCNA在AP的外周血中鉴定基因生物标志物,并通过确定嗜中性粒细胞中的特定功能亚群来提出COVID-19引起胰腺炎的潜在发病机制的研究。这些发现有助于急性胰腺炎的临床严重程度诊断和基础研究

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